Isoelektrische Fokussierung

[smiva]

Kann mir vielleicht jemand sagen, wie bei der Isoelektrischen Fokussierung der pH-Gradient hergestellt wird und wo die IEF Anwendung findet???

Vielen, vielen Dank im Vorraus!!! Smiva

[Gast]

Ja, im Gel selbst.
Es gibt käufliche Gele, die einen ph Gradienten im Gel besitzen, so daß die Proteine (z.B.) auf bestimmter Höhe fokussiert werden.

Ob man sich diese Gele auch selbst herstellen kann, weiß ich nicht..

[jellynina]

Argh, zweite Frage überlesen....

IEF wird z.B. dazu verwendet, wie der Name schon sagt- um den isoelektrischen Punkt von Proteinen zu bestimmen. Der gibt dann z.B. wiederum Aufschluß pb es das gesuchte ist, ob sich im Proezß Aminosäuren verändert haben, und allgemein um was es sich für ein Protein handelt, sauer, basiche. Es ist eine Einstiegsmethode zur Charakterisierung von Proben, wird nicht soooo häufig in der Qualiträtskontrolle etc. verwendet, oder verwendet es doch einer?????

[p53]

Man kann damit Proteine trennen. Die Proteine werden nach dem Isoelektrischen Punkt aufgetrennt, d.h. sie wandern im elektrischen Feld solange bis ihre Gesammtladung null ergibt was, wie wir ja alle wissen, am Isoelektrischen Punkt geschieht. Wird in der Proteomics vor allem bei der Anwendung in 2D Gelen benutzt. Hergestellt wird es über einen Gradientenmischer was aber heutzutage keiner mehr macht.

[Equilibrium]

Man kann diese Gele auch selbst herstellen. Auch wenn die Arbeit etwas sehr nervig ist und das kaum noch selber gemacht wird.
Wie auch immer, bei mir auf der Schule waren sie der Meinung, das gehöre zur guten Allgemeinbildung eines Chemikers dazu:

Es wird ein Polyacrylamid Gel mit sehr niedrigem Bisacrylamid verwendet. D.h. das Gel ist extrem grobmaschig und wabbelig. Um das Gel überhaupt handhaben zu können, wird es auf die hydrophile Seite Folie gegossen, welche "schlauerweise" auch eine hydrophobe Seite besitzt (*patsch* und schon war das Gel vom Kollegen am Laborboden, falsche Seite).

Anyways: Bevor das Gel gebrauchsfertig ist, wird vorfokussiert. D.h. das Gel wir mit Polyampholyten (langkettige aliphatische Polyamino-polycarbonsäuren, sauteuer) beladen und erstmal schön lange laufen gelassen. Da an Anode und Kathode Elektrolyse von Wasser stattfindet, bildet sich um die Elektroden ein entsprechendes alkalisches bzw. saures Mileau. Die Polyampholyten wandern Richtung Anode/Kathode und werden dort neutralisiert und dank den endlos vielen Säure/Aminogruppen puffern sie fort an ihren eigenen pH Wert ab. Je mehr unterschiedliche Polyampholyten verwendet werden, desto feiner wird der pH Gradient.

Wenn das Gel vorfokussiert wurde, werden die Proben in der Mitte des Gel per Probenkamm aufgetupft (jaja vorsichtig, lätschertes Gel) und die eigentliche Fokussierung im pH Gradienten geht von Statten. Zur Auswertung wird pH gegen Laufstrecke geplottet.