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Proteinfällung vor Aufreinigung

Auch hier wollen wir modern sein und somit darf auch diese Fachrichtung nicht fehlen

Moderator: Chemiestudent.de Team

Dobby
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Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von Dobby »

Hallo,

ich habe gelesen, dass einer Aufreinigung eines Proteins via Chromatographie oft eine Ausfällung durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels, z.B. Ammonsulfat, vorhergeht um das Protein anzukonzentrieren. Stimmt das bzw. kann mir jemand erklären, warum dem so ist? Man kann dadurch ja nicht die Menge an Protein erhöhen, sondern bloß die Konzentration im Volumen?

Danke!
Nobby
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Re: Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von Nobby »

Also Ammoniumsulfat ist ein Salz ein Feststoff und kein Lösungsmittel.
Das Salz ist ein ionische Verbindung, die Proteine denaturieren lässt.

Text angeben wo diese Reinigungsprozedur steht.
chemiewolf
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Re: Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von chemiewolf »

Die Fällung von Proteinen dient als erster Aufreinigungsschritt. Die Proteine verlieren dadurch aber ihre biologische Aktivität.
Dobby
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Re: Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von Dobby »

Danke Chemiewolf! :) und wie kann man sich es dann erklären, dass die Ausbeute eines Proteins am Ende der Aufreinigung (nach der Chromatographie) durch die stattfindende Fällung erhöht wird/ werden kann?

Nach dem Ausfällen wird doch grundsätzlich immer dialysiert ... wird das Protein dadurch wieder zurückgefaltet und bekommt somit seine Aktivität wieder?
Chemik-Al

Re: Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von Chemik-Al »

Du gehst stets von einer Proteinlösung aus(z.B. Lysat),wo noch anderen Stoffgruppen enthalten sind,die bei einer direkten Dialyse stören könnten.
In eine bestimmten Volumen einer solchen Lösung liegt nur ein bestimmte Menge an Protein vor.
Man wird bei jeder Art von Reinigung am Ende nie auf 100% des gesuchten Proteins kommen.
Die Ammoniumsulfat-Fällung ist eine Möglichkeit der Proteinfällung.Dadurch wird das Protein,neben anderen,ausgefällt,was formal einer Anreicherung entspricht.Das gefällte Protein kann nun gesondert behandelt werden,u.a. durch Chromatographie.
Die Ammoniumsulfat-Fällung ist in der Regel reversibel.

Chemik-Al.
chemiewolf
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Re: Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von chemiewolf »

Die Erhöhung der Ausbeute im Vergleich zum Nicht-Ausfällen ergibt sich durch die Anreicherung mittels Ausfällen. Würde man das nicht tun, bekäme man bei der Chromatographie sehr viele Mischfraktionen bzw. eine sehr erschwerte Trennung der Komponenten, was in einer schlechteren Ausbeute an reinem Protein resultiert.
Dobby
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Re: Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von Dobby »

Danke!
Es macht leider nur noch immer nicht so viel Sinn für mich. Ich denke mir, dass doch die absolute Menge an Zielprotein unverändert bleibt (bzw. sich sogar durch das Ausfällen evtl. vermindert?!) :/
Chemik-Al

Re: Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von Chemik-Al »

Ja,die Menge an Protein kann nach Aufreinigung nicht mehr als die enthaltene Ausgangsmenge sein,in der Regel wird sie durch Aufreinigung(Fällung,Dialyse,Chromatographie etc.) weniger.
Das jeweiligen Aufreinigungsverfahren hängt davon ab,welche Mengen und welcher Reinheitsgrad am Ende erwünscht wird.
gerade bei bisher noch nicht genau charakterisierten Proteinen ist die Reinheit ein viel wichtigerer Faktor,um z.B. Kristalle für RSA zu züchten.

Chemik-Al.
chemiewolf
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Re: Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von chemiewolf »

Dobby hat geschrieben: 21.06. 2022 14:44 Ich denke mir, dass doch die absolute Menge an Zielprotein unverändert bleibt :/
das ist natürlich richtig. Aber Ziel der Prozedur ist es, reines Protein zu erhalten und das mit einer möglichst guten Ausbeute, die natürlich immer unter der absolut vorhandenen Menge des Proteins liegt.
Die optimale Ausbeute erhält man aber nur, wenn man den Aufreinigungsweg so gestaltet, dass man die anderen Komponenten im Gemisch möglichst vollständig abtrennt.
Dobby
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Re: Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von Dobby »

Danke. D.h., dass es hier im Endeffekt doch um das gleiche geht wie insgesamt bei einer chromatographischen Aufreinigung: dadurch, dass andere (=störende) Proteine abgetrennt werden bzw. durch eine Fällung ankonzentriert wird, hat man relativ gesehen einfach mehr vom Zielprotein.

Ich habe letztens das Ergebnis einer Gelelektrophorese gesehen, d.h. die einzelnen Fraktionen, die im Rahmen einer Chromatographie erhalten wurden, wurden einzeln aufgetragen. Teilweise waren die Banden der einzelnen Fraktionen wirklich deutlich dicker als jene der ursprünglichen Probe. Das wird also allein durch die Aufreinigung erzielt! :shock:
Chemik-Al

Re: Proteinfällung vor Aufreinigung

Beitrag von Chemik-Al »

hat man relativ gesehen einfach mehr vom Zielprotein.
Das ist wieder unglücklich formuliert.
Die Menge eines extrahierten/aufgereinigten Stoffes wird niemals größer sein als die Menge des Stoffes im Ursprungsgemisch.
In der Regel erreicht man nie eine 100%ige Ausbeute an reinem Einzelstoff.Durch die chromatographischen Verfahren kann man versuchen,die gewünschte Kombination an ausbeute und Reinheit zu erzielen.
Ich habe letztens das Ergebnis einer Gelelektrophorese gesehen, d.h. die einzelnen Fraktionen, die im Rahmen einer Chromatographie erhalten wurden, wurden einzeln aufgetragen. Teilweise waren die Banden der einzelnen Fraktionen wirklich deutlich dicker als jene der ursprünglichen Probe. Das wird also allein durch die Aufreinigung erzielt!
Du hast hier ein Vortrennung durch Chromatographie,wodurch der gewünschte Stoff schon etwas sauberer ist,da viele andere Stoffe in den anderen Fraktionen blieben.
Nun werden aber oft solche erhaltenen Fraktionen aufkonzentriert und dann erst z.B. durch Gelelektrophorese weiter getrennt.
Durch das Aufkonzentrieren sieht die Bande halt dicker aus,aber es bleibt,daß nicht mehr Zielprotein enthalten sein kann als vor der Aufreinigung.

Chemik-Al.
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