von mospie » 20.04. 2007 06:08
Hilft dir das??
Laktat-Dehydrogenase (LDH) Test
Der LDH-Test ist ein sehr häufig angewendeter In-vitro-Zytotoxizitätstest, dessen Prinzip auf der Bestimmung der Enzymaktivität von Laktatdehydrogenase (LDH) im Zytoplasma basiert, das aus zerstörten oder beschädigten Zellen freigesetzt wird und somit im Überstand (in vitro im Zellkulturmedium) nachweisbar ist. Die Laktatdehydrogenase ist ein stabiles zytoplasmatisches Enzym, das sehr schnell in das Zellkulturmedium abgegeben wird, wenn die Zellmembran zerstört ist. Die LDH-Aktivität wird mittels eines enzymatischen Tests bestimmt. Es finden zwei Redoxreaktionen statt: Im ersten Schritt wird Laktat durch die Oxidoreduktase LDH zu Pyruvat oxidiert, während das Coenzym NAD+ durch die Übertragung von Wasserstoff (vom Substrat Laktat) zu NADH/H+ reduziert wird. Im zweiten Schritt transferiert der im Testreagenz enthaltene Katalysator Diaphorase Wasserstoff vom entstandenen NADH/H+ auf das schwach gelbfarbene Tetrazolium-Salz INT (2-[4-Iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazoliumchlorid), welches dadurch zu dem rot gefärbten Formazan-Salz reduziert wird, während das NADH/H+ zu NAD+ oxidiert wird. Diese Farbstoffbildung kann kolorimetrisch mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 490 nm (Referenzwellenlänge 690 nm) gemessen werden. Je höher der Grad der Zellschädigung ist, desto größer ist die Menge an freigesetztem LDH im Überstand (Medium). Diese Menge an LDH korreliert direkt mit der Menge an gebildetem Formazan-Salz und ist daher direkt proportional zur Anzahl geschädigter Zellen. Als Referenz dienen Kontrollansätze, d.h. Zellen, die unter Zugabe des Detergens Triton-X-100 (1 %, in Zellkulturmedium verdünnt) vollständig lysiert wurden und deren Substratumsetzung daher als maximal (100 %, Positivkontrolle) eingestuft wird, bzw. solche, die nur mit reinem Zellkulturmedium behandelt wurden und deshalb eine minimale (0 %, Negativkontrolle) LDH-Enzymaktivität im Überstand besitzen.
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Der LDH-Test ist ein sehr häufig angewendeter In-vitro-Zytotoxizitätstest, dessen Prinzip auf der Bestimmung der Enzymaktivität von Laktatdehydrogenase (LDH) im Zytoplasma basiert, das aus zerstörten oder beschädigten Zellen freigesetzt wird und somit im Überstand (in vitro im Zellkulturmedium) nachweisbar ist. Die Laktatdehydrogenase ist ein stabiles zytoplasmatisches Enzym, das sehr schnell in das Zellkulturmedium abgegeben wird, wenn die Zellmembran zerstört ist. Die LDH-Aktivität wird mittels eines enzymatischen Tests bestimmt. Es finden zwei Redoxreaktionen statt: Im ersten Schritt wird Laktat durch die Oxidoreduktase LDH zu Pyruvat oxidiert, während das Coenzym NAD+ durch die Übertragung von Wasserstoff (vom Substrat Laktat) zu NADH/H+ reduziert wird. Im zweiten Schritt transferiert der im Testreagenz enthaltene Katalysator Diaphorase Wasserstoff vom entstandenen NADH/H+ auf das schwach gelbfarbene Tetrazolium-Salz INT (2-[4-Iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazoliumchlorid), welches dadurch zu dem rot gefärbten Formazan-Salz reduziert wird, während das NADH/H+ zu NAD+ oxidiert wird. Diese Farbstoffbildung kann kolorimetrisch mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 490 nm (Referenzwellenlänge 690 nm) gemessen werden. Je höher der Grad der Zellschädigung ist, desto größer ist die Menge an freigesetztem LDH im Überstand (Medium). Diese Menge an LDH korreliert direkt mit der Menge an gebildetem Formazan-Salz und ist daher direkt proportional zur Anzahl geschädigter Zellen. Als Referenz dienen Kontrollansätze, d.h. Zellen, die unter Zugabe des Detergens Triton-X-100 (1 %, in Zellkulturmedium verdünnt) vollständig lysiert wurden und deren Substratumsetzung daher als maximal (100 %, Positivkontrolle) eingestuft wird, bzw. solche, die nur mit reinem Zellkulturmedium behandelt wurden und deshalb eine minimale (0 %, Negativkontrolle) LDH-Enzymaktivität im Überstand besitzen.
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