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Der Workflow stimmt so wie beschrieben. Zellen sind Human aortic smooth muscle cells, Bedingungen sind saure Medien mit pH 6.8 - eingestellt zum Einen mit HCl und zum Anderen mit Milchsäure. Da sich unsere Arbeitshypothese um Milchsäure dreht bzw. ggf. um das Anion, ist eine weitere Bedingung ein Medium mit hoher Laktat-Konzentration. Als Osmolalität-Kontrolle die fünfte Bedingung mit Mannitol (Fünf Bedingungen: 1. Kontrolle (pH 7.4); 2. pH 6.8 HCl; 3. pH 6.8 Milchsäure; 4. pH 7.4 Mannitol; 5. pH 7.4 NaLaktat). Der Reaktionspuffer (mit dementsprechenden p-Nitrophenylphosphat; ZnCl2; MgCl2, pH 9. wurde für alle Lysate verwendet, dh. Edukt-Konzentration ist konstant für alle Bedingungen. Auf Transkript-Ebene sahen wir eine Hochregulation für ALPL (tissue non specific isoform) und wollten es direkt auf Aktivitäts-Ebene überprüfen, dort zeigte sich eine Steigerung von ca. 30%. Da Enzymologie schon etwas länger her ist, stelle ich mir die Frage, ob unsere Bedingungen auf eine Art und Weise die ALP-Aktivität langfristig verändern kann bei angenommener konstanter Enzymmenge. Für die Denkanregung bzgl. der PTM bin ich sehr dankbar!

PS: Wir haben auch gesehen, dass das Enzym ENPP1 ("Gegenspieler" der ALP) auf Transkriptebene herunterreguliert wurde. Die Aktivitätsmessung zeigte jedoch eine Erhöhung um 25%. Derzeit versuchen wir diesen konträren Effekt zu verstehen, da sich dies nicht durch eine verstärkte Expression auf Proteinebene der ENPP1 erklären lässt.

Ich verstehe das so,daß noch intakte Zellen einer bestimmten Behandlung unterzogen ,dann lysiert werden und das Zelllysat auf ALP-Aktivität getestet wird.
Die Messung erfolgt unter Bedingungen,die für alle Lysate gleich sind und bei einem Lysat wurde eine höhere EA gemessen als in dem Lysat der unbehandelten Kontrollzellen.
Eine höhere Aktivität kann an einer höheren Menge ALP im Lysat liegen,wo dann bei der "Behandlung" der Zellen eine verstärkte Expression/Enzymsynthese die Ursache ist.
Theoretisch könnte die Effektivität eines Enzyms auch durch posttranslationale Modifikation des Proteins gesteigert werden,die EA der verschiedenen natürlichen ALP unterscheidet sich ja ebenfalls.
Da nicht bekannt ist,welcher Art die "Behandlung" bei eurem Versuch war,kann man da nichts zu sagen.
Ich halte es für wahrscheinlicher,daß mehr Enzym enthalten ist.
Wie groß ist denn die Abweichung?

Chemik-Al.

Hallo,

mich beschäftigt gerade die logische Abfolge für die Erhöhung der Aktivität eines Enzyms. Ich rede hier nicht von den bekannten Faktoren wie Temperatur beispielsweise. Derzeit analysieren wir in vitro mittels frischen Zelllysaten die Aktivität eines darin enthaltenen Enzyms (alkalische Phosphatase = ALP). Dabei wurden die Zellen mit fünf verschiedenen Bedingungen 48h vorher behandelt und die Aktivität der alkalische Phosphatase innerhalb dieser Versuchsgruppen verglichen. Verwendet wurde p-Nitrophenylphosphat welches durch die ALP dephosphoryliert wird und dabei p-Nitrophenyl entsteht, welches widerrum im Rahmen einer kolorimetrischen Messung quantifiziert wird (und dementsprechend auf die Enzymaktivität geschlussfolgert wird). Eine Behandlung zeigt nun im Vergleich zur Kontrolle eine erhöhte Aktivität der ALP. Die Frage ist nun, ob dies "nur" auf eine erhöhte Menge/Konzentration des Enzyms zurückzuführen werden kann oder ob es noch andere Faktoren gibt, die die Aktivität des Enzyms ohne Änderung der Menge steigern können. Etwaige (isosterische/allosterische) Aktivatoren scheint es für die ALP nicht zu geben.

LG