Kristallisation und Strukturanalyse einer Kinasedomäne

[citsch]

Hallo,

ich muss demnächst eine Vortrag über den Artikel "Crystal structure of the protein kinase domain of yeast AMP-activated protein kinase Snf1" (Rudolph et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 337 (2005) 1224–1228) halten. Wie der Titel schon darauf hinweist wurde in diesem Artikel eine Untersuchung der der zuvor kristallisierten Kinasedomäne der alpha-Untereinheit des SNF1-Komplexes der Hefe (gehört zur Unterfamilie der AMP-aktivierten Proteinkinasen) vorgestellt.

Leider verstehe ich einige Teile des Artikels nicht ganz (teilweise inhaltlich, teilweise auch wegen der englischen Sprache) und keine Möglichkeit mich mit dem Betreuer des Vortrages auszutauschen, da einerseits ich ein Praktikum am anderen Ende der Stadt habe und andererseits auch er wenig Zeit hat. Aber vielleicht kann mir ja hier jemand helfen?

Folgende Punkte sind mir derzeit unklar:

1.) Im Artikel heißt es: "A selenomethionyl single-wavelength
anomalous diffraction (SAD) data set to 2.6A ˚ resolution were
collected on a crystal of the kinase domain."

Untersucht wurde die Kristallstruktur also mit Hilfe der "selenomethionyl single-wavelength anomalous diffraction (SAD)"-Methode (Röntgenstrahlbeugung). Kann mir jemand etwas zu der Methode sagen? Wie wird sie durchgeführt? Was unterscheidet sie von anderen Röntgenstrahlbeugungsverfahren?

2.) Dann heißt es weiterhin: "The reflection phases were determined with the
program Solve/Resolve".

Was sind Reflexionsphasen?

3.) Außerdem heißt es in dem Artikel: "For structure refinement, diffraction data set to 2.2A ˚ resolution were collected on a native crystal of the kinase domain at the X4A beamline."

Was bedeutet hier Strukturverbesserung ("structure refinement")? Heißt das, dass der Versuchsaufbau zunächst bei 2,6 Ångström geeicht wurde (s.o.) und dann bei 2,2 Å die eigentliche Messung durchgeführt wurde?

---

Unter "result and discussion" heißt es in dem Artikel: The current atomic model contains residues 48–58, 67–89, 96–199, and 215–315, and residues 48–59, 68–90, 96–199, 215–224, and 230–315 for the two kinase domain molecules in the crystallographic asymmetric unit, respectively, with an R factor of 25.3%." Hierzu folgende drei Fragen:

4.) Ich vermute mal "the current atomic model", was ich mit "das gegenwärtige / derzeitige Atommodel" übersetzen würde bezieht sich auf die Untersuchungen der Ersteller dieses Artikels? Beim ersten Durlesen habe ich es nämlich auf vorhergende Studien bezogen.

5.) Noch einmal zur Kristallisation: Hat es irgendeine methodische Bewandnis, dass sich zwei Moleküle in der Einheit befinden (und wieso ist diese asymmetrisch?)

6.) Was ist in diesem Fall mit R-Faktor gemeint? Dabei handelt es sich doch nicht um die Größe des Fehlers, oder? Hängt der mit dem im folgenden Satz genannten Ramachandran-Plot zusammen?

"The majority of the residues (89%) are in the most favored region, while none
of the residues are in the disallowed region of the Ramachandran plot (data not shown)."

7.) Zu diesem Satz habe ich auch eine Frage. Was ist mit "disallowed region of the Ramachandran plot" gemeint?

---

8.) Was bedeutet "Residues ... are disordered in the structure?" Die Übersetzung "unordentlich" für "disordered" scheint mir nicht zu passen.

9.) Muss ich "rms distance" mit Standardabweichung übersetzen?

Wäre schön, wenn mir jemand einige der Fragen beantworten könnte. Vielen Dank und viele Grüße.

[Equilibrium]

Hallo citsch,

Kristallographie ist zwar nicht unbedingt mein Lieblingsgebiet, aber mal sehen, was ich Dir erklären kann.

1.) Im Artikel heißt es: "A selenomethionyl single-wavelength
anomalous diffraction (SAD) data set to 2.6A ˚ resolution were
collected on a crystal of the kinase domain."

Untersucht wurde die Kristallstruktur also mit Hilfe der "selenomethionyl single-wavelength anomalous diffraction (SAD)"-Methode (Röntgenstrahlbeugung). Kann mir jemand etwas zu der Methode sagen? Wie wird sie durchgeführt? Was unterscheidet sie von anderen Röntgenstrahlbeugungsverfahren?

2.) Dann heißt es weiterhin: "The reflection phases were determined with the
program Solve/Resolve".

Was sind Reflexionsphasen?

Das Hauptproblem bei x-ray diffraction ist die unbekannte Phase, welche bei den Röntgenstrahlen durch die Beugung verschoben wird. Nun sind diese aber wichtig um überhaupt erst eine "electron density map", per Fourier Transformation zu errechnen. Deswegen werden verschiedene Methoden angewandt um die Phasenverschiebung zu bestimmen. Eine der zahllosen Möglichkeiten dürfte SAD sein.

Zum Thema Phase gibt's auf Wikipedia einen guten Artikel:
http://en.wikipedia.org/wiki/Phase_(waves)

3.) Außerdem heißt es in dem Artikel: "For structure refinement, diffraction data set to 2.2A ˚ resolution were collected on a native crystal of the kinase domain at the X4A beamline."

Was bedeutet hier Strukturverbesserung ("structure refinement")? Heißt das, dass der Versuchsaufbau zunächst bei 2,6 Ångström geeicht wurde (s.o.) und dann bei 2,2 Å die eigentliche Messung durchgeführt wurde?

Was macht man normalerweise, wenn ein Versuch keine ausreichend guten Ergebnisse liefert? Genau - man wiederholt ihn. Auf 2.6 Angström war's unzureichend aufgelöst, ergo auf 2.2 Å nochmals.

Unter "result and discussion" heißt es in dem Artikel: The current atomic model contains residues 48–58, 67–89, 96–199, and 215–315, and residues 48–59, 68–90, 96–199, 215–224, and 230–315 for the two kinase domain molecules in the crystallographic asymmetric unit, respectively, with an R factor of 25.3%." Hierzu folgende drei Fragen:

4.) Ich vermute mal "the current atomic model", was ich mit "das gegenwärtige / derzeitige Atommodel" übersetzen würde bezieht sich auf die Untersuchungen der Ersteller dieses Artikels? Beim ersten Durlesen habe ich es nämlich auf vorhergende Studien bezogen.

Damit ist das neu erstellte Model gemeint. Scheinbar waren die Strukturen nicht überall in hinreichendem Detail analysiert worden (d.h. an manchen Stellen hatten die keine Ahnung, welche Aminosäure sie in die electron density map quetschen sollen).

5.) Noch einmal zur Kristallisation: Hat es irgendeine methodische Bewandnis, dass sich zwei Moleküle in der Einheit befinden (und wieso ist diese asymmetrisch?)

Bei einem Proteinkristall gibt es eine sogenannte Unit-cell, welche sich dann in allen drei Raumrichtungen wiederholt. Ob in dieser Unit-cell nun ein, zwei oder fünf Moleküle sind, tut nichts zur Sache.

6.) Was ist in diesem Fall mit R-Faktor gemeint? Dabei handelt es sich doch nicht um die Größe des Fehlers, oder? Hängt der mit dem im folgenden Satz genannten Ramachandran-Plot zusammen?

Genau, es ist ein Fehlerfaktor. Beim R-Faktor wird mit dem erstellen Model ein Beugungsmuster errechnet und dann mit dem wirklichen Beugungsmuster verglichen. Alle Werte unter 30% sind schon recht passable Modelle.

"The majority of the residues (89%) are in the most favored region, while none
of the residues are in the disallowed region of the Ramachandran plot (data not shown)."

7.) Zu diesem Satz habe ich auch eine Frage. Was ist mit "disallowed region of the Ramachandran plot" gemeint?

Es gibt für Peptidbindungen instabile Winkel, wenn sich z.B. die beiden Carbonyl- oder Amingruppen zu Nahe kommen.

8.) Was bedeutet "Residues ... are disordered in the structure?" Die Übersetzung "unordentlich" für "disordered" scheint mir nicht zu passen.

Frei ohne Zusammenhang würde ich meinen, dass auf den Seitenketten keinerlei Spannung liegt und diese in der Konformation mit dem niedrigsten Energieniveau herumbaumeln. Es existieren kaum Peptide, bei denen die Seitenketten irgendwelchen strain forces ausgesetzt sind.

9.) Muss ich "rms distance" mit Standardabweichung übersetzen?

Da bin ich leider überfragt.

Ciao
Equi

[ondrej]

rms steht für root mean square, also die Wurzel der einzelnen dx, ich denke man kann es als Standartabweichung übersetzen

[citsch]

Danke euch beiden!

Was macht man normalerweise, wenn ein Versuch keine ausreichend guten Ergebnisse liefert? Genau - man wiederholt ihn. Auf 2.6 Angström war's unzureichend aufgelöst, ergo auf 2.2 Å nochmals.

Zu dieser Sache konnte ich jetzt doch noch jemand anderen fragen. Der hat meine Vermutung bestätigt, dass das Gerät offenbar mit Selenomethionin bei 2.6 Angström geeicht und bei 2,2 Å das native Protein gemessen wurde.

5.) Noch einmal zur Kristallisation: Hat es irgendeine methodische Bewandnis, dass sich zwei Moleküle in der Einheit befinden (und wieso ist diese asymmetrisch?)

Bei einem Proteinkristall gibt es eine sogenannte Unit-cell, welche sich dann in allen drei Raumrichtungen wiederholt. Ob in dieser Unit-cell nun ein, zwei oder fünf Moleküle sind, tut nichts zur Sache.

Nun ja, für die von den Leuten durchgeführte Strukturaufklärung ist es schon interessant. Offenbar sind immer zwei Moleküle in einer Einheit vorhanden, die dann auch in besonderer Weise miteinander interagieren. Das wird im Artikel ausführlich diskutiert. Sie schließen aufgrund dieser Interaktion z.B. auch auf die Funktionsweise der Kinase.

Viele Grüße.

[Equilibrium]

Nun ja, für die von den Leuten durchgeführte Strukturaufklärung ist es schon interessant. Offenbar sind immer zwei Moleküle in einer Einheit vorhanden, die dann auch in besonderer Weise miteinander interagieren. Das wird im Artikel ausführlich diskutiert. Sie schließen aufgrund dieser Interaktion z.B. auch auf die Funktionsweise der Kinase.

Das war dann wohl beabsichtigt, um Substratinteraktionen genauer beschreiben zu können. Bei Enzymen mit kurzlebigeren Substraten, werden meisten Substratanaloga verwendet, welche zwar ins aktive Zentrum passen, aber keine catalysierbare Reaktion liefern.

ciao
Equi